Отбор патологического материала для диагностики некоторых вирусных болезней сельскохозяйственных животных

ЛАБОРАТОРНО – ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗАНЯТИЕ № 2.

Подготовка вируссодержащего материала для заражения и транспортировки лабораторных объектов

Цель занятия: ознакомиться с техникой взятия, транспортировки и упаковки, подготовки и сохранения вируссодержащего материала для заражения лабораторных животных, культуры клеток и куриных эмбрионов.

материалы и Оборудование: пенициллиновые флаконы с кусочками паренхиматозных органов, залитых раствором Хенкса и замороженных, стерильные фарфоровые ступки с пестиками, стерильный стеклянный песок, стерильные чашки Петри (по две на рабочее место), стерильные центрифужные пробирки (количество их должно соответствовать числу рабочих мест), раствор Хенкса, стрептомицин и пенициллин, МПА, МПБ в пробирках на каждое рабочее место, стерильные пенициллиновые флаконы, стерильные резиновые пробки №14 либо 14,5, ножницы, пинцеты, спиртовки, центрифуга, бумажные фильтры, таблицы по теме.

На протяжении независимой работы студентов нужно

1. Подготовить исследуемый материал для заражения лабораторных животных, культур клеток и куриных эмбрионов методом обработки антибиотиками.

2. Проверить полученный материал на стерильность методом высева на МПА, МПБ.

Примерный замысел занятия (2 ч)

1. Контрольные вопросы.

2. Объяснения учителя.

3. Демонстрация: а) инструментов и набора посуды;

б) приемов взятия смывов со слизистой оболочке оболочки носовой полости, конъюнктивы, прямой кишки у других животных и телят;

в) этикетирования и транспортировки забранного материала.

4. Независимая работа студентов.

5. Подведение итогов занятия.

6. Задание к следующему занятию.

Методические указания

Занятие возможно совершить следующим образом. Первый час посвятить демонстрации и объяснению приемов взятия материала от животных, находящихся в клинике университета. Второй час студенты выполняют работу по подготовке материала к изучению.

На данном занятии ограничиваются лишь демонстрацией взятия материала от животных, поскольку целый процесс студенты будут отрабатывать при прохождении учебно-производственной практики.

Вопросы домашнего задания

1. химический состав и Морфология вирусов.

2. Структуравирусов.

3. Функции нуклеиновой кислоты и вирусного белка в онтогенезе вирусов.

4. Способы лабораторной диагностики вирусных зараз.

5. Микроскопический способ изучения.

Краткие теоретические сведения

Вирусологическое изучение сводится к выделению вируса из патматериала, его серологической идентификации и подробному изучению разных особенностей (патогенность, антигенность, культивируемость в лабораторных условиях, морфологические показатели).

В каждом случае заболевания с подозрением на вирусную этиологию первым делом нужно выделить возбудителя из патматериала. В данной связи верный отбор, упаковка, обработка и транспортировка материала имеют большое значение для успешной постановки диагноза на вирусное заболевание.

Материал для изучения. От заболевших, павших либо вынужденно убитых животных его отбирают как возможно стремительнее по окончании появления четких показателей заболевания либо не позднее 2…3 ч по окончании их клинической смерти либо убоя. Это связано с тем, что сразу после заболевания либо в первые 1-2 дня заболевания существенно ослабевает барьерная роль кишечника, что наровне с повышенной проницаемостью кровеносных сосудов, содействует распространению кишечной микрофлоры

При взятии материала для выделения вируса направляться исходить из патогенеза изучаемой заразе (входные ворота, пути распространения в организме, пути выделения и места репродукции). Так, при респираторных заразах для выделения вирусов берут носоглоточные смывы, мазки из глотки и носовой полости, кусочки и соскобы трахеи легкого трупов; при энтеровирусных — кал; при нейротропных — кусочки головного либо спинного мозга; при дерматропных заразах — свежие поражения кожи и т.п., т.е. отбирают тот материал, в котором предполагается громаднейшая концентрация вируса. Материалом для выделения вируса могут служить секреты и различные экскреты, кусочки органов, кровь, лимфа и пр.

При вскрытии трупов животных материал отбирают при строгом соблюдении всех правил асептики и антисептики, дабы не заразиться самому, не внести посторонних возбудителей в исследуемый материал и не допустить распространения инфекционного начала.

Кровь берут из яремной вены, кончика хвоста либо уха, венозного сплетения глаз и т.д.

Для выделения вируса применяют цельную дефибринированную, лаковую кровь (смесь крови с дистиллированной водой в отношении 1:1), или отдельные элементы крови (эритроциты, лейкоциты, плазма, сыворотка).

Для обнаружения антивирусных антител кровь берут у одного и того же животного два раза с промежутком в 2…3 семь дней (чтобы получить парные сывороток в количестве не меньше 5,0 мл каждой).

Смывы со слизистой оболочке оболочки носовой полости, глаз, с задней стены глотки, клоаки и прямой кишки у птиц берут стерильными ватными тампонами и погружают их в пенициллиновые флаконы либо пробирки, которые содержат 3-5 мл соответствующей жидкости. Чаще всего для этого применяют раствор Хенкса либо среды для культур клеток (ГЛА, 199, Игла) с антибиотиками (пенициллин, стрептомицин по 500 ЕД и нистатин по 20 ЕД на 1 мл среды) с протеиновым стабилизатором, к примеру, 0,5%-ным раствором желатина либо 0,5…1%-ным раствором альбумина бычьей сыворотки. Присутствие стабилизаторов нужно для предотвращения стремительной инактивации некоторых вирусов, к примеру, вируса парагриппа.

При взятии материала из носоглотки возможно применять прибор, сконструированный Стоком и Томасом. Он складывается из трубки диаметром 9 мм и длиной 30 см, в которой помещается вторая узкая трубка с нержавеющим стержнем, оканчивающимся нейлоновой щеткой. Прибор вводят глубоко в носовые ходы (хоаны) либо в горло через носовой движение, выдвигая щеточку, а после этого снова задвигая ее в трубку перед тем, как вынуть прибор из органа. Щеточку шепетильно отмывают от клеток и слизи в 2 мл жидкости (раствор Хенкса).

Слюну отбирают при наличии показателей поражения ротовой полости либо слюнных желез. Вытекающую изо рта слюну возможно собрать прямо в пробирку. В случае, если ее выделяется мало либо она не вытекает, нужно пропитать слюной стерильный тампон на палочке, а после этого поместить в пробирку с маленьким числом раствора Хенкса и закрыть резиновою пробкой. Для усиления слюноотделения животному возможно ввести пилокарпин из расчета 0,02…0,05 г на 1 кг массы.

Мочу отбирают при помощи катетера в стерильную посуду.

Фекалии берут из прямой кишки при помощи шпателя либо палочкой и помещают в стерильную пробирку либо пенициллиновый флакон.

Везикулярную жидкость собирают шприцем либо пастеровской пипеткой в стерильную пробирку.

Стены афт, корочки с поверхности кожи снимают пинцетом.

Спинномозговую жидкость берут асептически методом простой пункции.

В качестве патматериала применяют кусочки органов количеством пара см3 и массой 10-20 г, каковые:

а) имеют видимые отклонения от нормы по форме, размеру, цвету, консистенции, наличию необыкновенных образований;

б) смогут быть поражены и содержать вирус;

в) чаще всего содержат вирус — печень, селезенка, легкие, мозг , лимфатические узлы, почки.

Таблица 1.

Отбор патологического материала для диагностики некоторых вирусных заболеваний сельскохозяйственных животных

хранение и Транспортировка проб. Забранные пробы нужно как возможно стремительнее поместить в условия, снабжающие замедление процессов инактивации вируса. Такие условия снабжают низкие температуры. Для этого пробирки (флакончики) с патматериалом, закрытые резиновыми пробками, помещают в термос с охлаждающей смесью.

Структура упаковочного контейнера:

Первичная емкость: емкость, содержащая пробу (пробирка с завинчивающейся пробкой с нетоксичной резиновой прокладкой, обернутой лейкопластырем, либо запаянная стеклянная ампула);

Внутренняя упаковка: — поглощающий материал — папиросная бумага либо вата числом, достаточном для впитывания жидкости при утечки;

— пластиковый мешок, заполненный либо заклеенный неволокнистым лейкопластырем;

Наружная упаковка: -противоударная прокладка, (скомканная бумага либо вата);- жёсткий влагонепроницаемый контейнер;- хорошо пригнанная крышка, завинчиваемая либо уплотняемая, заклеиваемая лейкопластырем либо закрепляемая зажимами.

В качестве охлаждающей смеси применяют смесь равных частей сухого льда (жёсткая углекислота) и этилового спирта, тогда температура минус 71 °С держится пара дней. Возможно применять смесь, складывающуюся из трех весовых частей льда либо снега и одной весовой части поваренной соли. В последнем случае удается взять температуру минус 15… 20 °С. Вместо замораживания возможно применять химические консерванты, но это менее действенно. Лучшим из них считается смесь равных количеств стерильного глицерина и 0,85%-ного раствора поваренной соли (изотонический раствор). В большинстве случаев эту смесь советуют применять для консервирования кусочков паренхиматозных тканей и органов.Глицерин — это несложный трехатомный спирт. Он смешивается с большинством компонентов живой клетки. В него скоро диффундирует электролиты и вода, а сам он легко попадает в гели и другие растворы и не переходит в жёсткое состояние при низких температурах — минус 110 °С.

Растворы глицерина менее пригодны для вируссодержащих жидкостей, в особенности в тех случаях, в то время, когда данный материал необходимо вводить животным, эмбрионам и в культуру клеток в неразведённом виде. Потребление его делает неосуществимым изучение патологического материала способом иммунофлуоресценции, исходя из этого в один момент с пробой патматериала нужно направить мазки-отпечатки, приготовленные и фиксированные на предметном стекле, для изучения на люминесцентном микроскопе.

Патматериал снабжают надежной и четкой этикеткой (рис.1.) недопустимо делать надписи карандашом по стеклу. На пробирке либо флакончике достаточно надежной есть этикетка из лейкопластыря, которую подписывают несложным карандашом. На термос с пробами патматериала навешивают бирку из картона либо фанеры, на которою показывают хозяйство, вид животного, вид материала и дату. Термос опечатывают. Забранный материал с сопроводительным документом, содержащим все данные о животном, от которого забраны пробы, об эпизоотологических данных хозяйства, предположительном диагнозе мерах, принятых для ликвидации заболевания (лечение, вакцинации и т.д.), и фамилию и дату ветврача, направляют с нарочным. Этими данными руководствуются при выборе направления лабораторных изучений. Доставленные в лаборатории пробы рекомендуется срочно применять для выделения вируса. В случае, если не известно почему (отсутствие экспериментальных животных, куриных эмбрионов, культур клеток) изучение откладывается, материал хранят при температуре минус (40… 70) °С. Большая часть вирусов в крови, спинномозговой жидкости, моче, смывах и соскобах носоглотки скоро разрушается, а вирус парагриппа кр. рог. скота и респираторно-синцитиальный вирус скоро погибают при замораживании, исходя из этого успех их выделения зависит от быстроты изучения. В случае, если нет уверенности в том, что исследуемое инфекционное заболевание было вызвано лишь вирусом, часть материала направляться дать для бактериологического и микологического изучений.

Подготовка вируссодержащего материала. В лаборатории полученный патматериал освобождают от консерванта, оттаивают, отмывают от глицерина, взвешивают либо измеряют. Часть берут для вирусологического анализа, оставшуюся — хранят в холодильнике на случай необходимости дополнительных изучений. После этого составляют замысел изучений отправленного материала.

Подготовку вируссодержещего материала для заражения чувствительных объектов реализовывают двумя способами: посредством обработки антибиотиками либо методом стерилизующего фильтрования.

Подготовка тканей и органов. Вирус нужно высвободить из тканей и клеток органов и перевести в раствор Хенкса. Для этого материал шепетильно измельчают ножницами и растирают в ступке со стерильным кварцевым песком. Додавать толченое стекло менее нужно, поскольку оно владеет щелочными особенностями и может инактивировать часть вирусных частиц. Но и на тонко растертых песчинках либо частицах стекла, владеющих громадной поверхностью, часть вируса может адсорбироваться и уйти после этого в удаляемый осадок. Из растертого материала в большинстве случаев готовят 10%-ную суспензию на растворе Хенкса. Взятую суспензию на растворе Хенкса центрифугируют при 1500…3000 об/мин в течение 15…30 мин, надосадочную жидкость отсасывают в стерильные флаконы и освобождают от микрофлоры, или пропуская через бактериальные фильтры (это делают редко, поскольку теряется довольно много вируса за счет адсорбции на фильтре), или обрабатывают антибиотиками многих действия (пенициллин, стрептомицин, нистатин, тетрациклин, кристалломицин и т.д.). Дозы антибиотиков, используемых для данной цели, смогут колебаться в достаточно широких пределах (от 100 до 1…2 тыс. ЕД и более на 1 мл) в зависимости от характера исследуемого материала. Советуют следующие дозы антибиотиков- пенициллина 1000 ЕД, тетрациклина 100 мкг, стрептомицина 500 ЕД, нистатина 30 ЕД на 1 мл. направляться избегать излишне громадных доз, поскольку их избыток при предстоящем внесении в культуру клеток может привести к неспецифической дегенерации последних. Предпочтительность тех либо иных доз антибиотиков и оптимальный режим центрифугирования в каждом конкретном случае указан в инструкции по диагностике соответствующих вирусных заболеваний.

Экспозиция суспензии с антибиотиками должна быть не меньше 30…60 мин при комнатной температуре, после этого материал подвергают бактериологическому контролю на наличие бактерий, грибов методом посева на МПА, МПБ, МППБ и среду Сабуро. По окончании получения отрицательного результата бактериологического контроля вируссодержащий материал применяют для заражения лабораторных животных, культур клеток и куриных эмбрионов. При хорошего бактериологического контроля суспензию вируса подвергают дополнительной обработке антибиотиками и повторно ставят контроль. Суспензию хранят при минус (20… 70) °С.

Подготовка выделении из глаз и носа. Тампоны загружённые в соответствующий раствор, встряхивают 10…15 мин, шепетильно отжимают, взятую жидкость центрифугируют 20 мин при 2000…3000 об/мин. Надосадочную жидкость отсасывают в стерильную пробирку и в нее додают стрептомицин и пенициллин по 500…1000 ЕД на 1 мл, выдерживают и по окончании бактериологического контроля применяют для заражения. Из осадка клеток готовят мазки для РИФ.

Подготовка фекалий. Пробу кала (примерно около 1 г) помещают в баночку с бусами, содержащую 10 мл раствора Хенкса. По окончании гомогенизации материала встряхиванием и последующего центрифугирования при 2000…3000 об/мин в течение 30 мин надосадочную жидкость отсасывают, додают пенициллин, стрептомицин по 500… 1000 ЕД/мл, нистатин 30 ЕД/мл и тетрациклина 200 мкг/мл. По окончании 30…60 мин контакта создают посев на стерильность, замораживают и хранят при минус (10… 20) °С. В сутки заражения животных либо культуры клеток исследуемый материал оттаивают и повторно центрифугируют для удаления снова образующегося поле замораживания осадка. Неиспользованный материал хранят в замороженном состоянии до конца изучений. Изучение кала возможно заменено ректальными мазками, обработка которых требует меньше времени, а частота выделения вируса наряду с этим не только не меньше, но время от времени выше.

Мочу обрабатывают антибиотиками 500…1000 ЕД/мл и применяют для заражения.

При кожных высыпаниях исследуют содержимое папул, пузырьков и пустул, корки и чешуйки. Содержимое папул и пузырьков разводят раствором Хенкса в соотношении 1:5, а корки, чешуйки по окончании растирания суспендируют в солевом растворе 1:5-1:10 и подвергают центрифугированию при 2000…3000 об/мин в течение 10… 15 мин. По окончании обработки стрептомицином и пенициллином (по 200…500 ЕД/мл) материал применяют для заражения.

Подготовка крови. Для выделения вируса возможно использована цельная дефибринированная, лаковая кровь либо кровь с антиксагулянтом. В последнем случае берут 5 мл крови в пробирку с 5-6 каплями гепарина и замораживают. По окончании оттаивания гемолизированную кровь центрифугируют при 2000…3000 об/мин в течение 15 мин, додают стрептомицин и пенициллин из расчета 100… 200 ЕД/мл и по окончании проверки на стерильность применяют для заражения. Для этих целей пригодна и свернувшаяся кровь. Ее растирают в ступке и додают маленькое количество раствора Хенкса (1:1 либо 1:2), а потом поступают подобно.

Для освобождения вируссодержащего материала от микроорганизмов используют стерилизующее фильтрование. Значительно чаще применяют асбестовые пластинки, керамические свечи, коллодийные мембраны и стеклянные фильтры. Асбестовые фильтры готовят из прессованного асбеста в виде кружков диаметром35,140 и 350 мм. Производят фильтры марки Ф (фильтрующие), задерживающие взвешенные частицы, но пропускающие частично бактерии, и СФ (стерилизующие), задерживающие все виды бактерий, не пропускающие вирусы.

Коллодийные мембраны (ультрафильтры) готовят из нитроклетчатки (коллодия) с совершенно верно калиброванными порами. Время от времени их именуют градоколовыми фильтрами (англ. graduate — калибровать; кол — от слова коллодий). Широкое распространение взяли мембранные фильтры. Для фильтрования вирусов применяют фильтры с диаметром пор 100-400 нм. На данный момент мембранные фильтры являются самые совершенными.

Керамические свечи являются удлиненной формы полые цилиндры, закрытые в нижней части (свечи Шамберлена, Беркефельда, каолиновые фильтры Петербургского керамического НИИ). Их изготовляют из каолина с разной степенью порозности.

Стеклянные фильтры готовят из пористого стекла. Сейчас достаточно широкое распространение взяли фильтры Шота с пластинкой №5 из сплавленных небольших гранул отекла.

Суспензии, которые содержат вирус, перед фильтрованием нужно высвободить от неотёсанной взвеси. Для этого их сначала центрифугируют в течение 10…15 мин при 1500…2000 об/мин и фильтруют через бумажный фильтр громадной порозности (800 нм). Суспензия, подлежащая стерилизующему (последнему) фильтрованию, должна быть прозрачной и только легко опалесцирующей. Жидкость, хранившуюся на холоде, перед фильтрованием рекомендуется в течение часа выдержать при комнатной температуре, а после этого необходимый ее количество вылить в стакан фильтровального прибора. В приемном сосуде (колбе) создают разрежение при помощи водоструйного либо масляного насоса. Фильтрат контролируют на стерильность (наличие бактерий, грибов) методом посева на МПА, МПБ, среду Сабуро.

направляться подчернуть, что фильтрование сопровождается адсорбцией вируса на фильтре и ведет к его большим утратам.

Отбор крови для серологических изучений. Для серологической диагностики нужно иметь две пробы сыворотки крови (парные сыворотки), взятые в начале и в конце заболевания. Первую пробу берут как возможно раньше — в инкубационный период либо в начале проявления клинических признаков заболевания, вторую — на протяжении выздоровления либо через 2…3 семь дней по окончании заболевания. Брать кровь и готовить сыворотку нужно стерильно, нельзя применять энтикоагулянты либо консерванты, каковые смогут придать сыворотке антикомплементарность, а в реакции нейтрализации оказать инактивирующее воздействие на вирус, появляться токсичными для культур клеток либо легко нестерильными. Кровь в количестве 10… 15 мл берут в стерильные пробирки с резиновыми пробками, выдерживают при комнатной температуре до образования сгустка, обводят стеклянной палочкой либо вторым инструментом и переносят в холодильник при 4 °С на 18… 20 ч. По окончании большой ретракции сгустка сыворотку отсасывают, додают стрептомицин и пенициллин по 100 ЕД/мл, выполняют высевы на бактериологические среды. Вместо отстаивания в холодильнике возможно по окончании обведения кровь центрифугировать.

Серологические способы вирусологической диагностики требуют изучения парных проб сывороток, исходя из этого нужно верно сохранять первые пробы, пока не будут взяты вторые. Хранить сыворотки нужно в холодильнике при 4 °С либо в замороженном виде, строго выполняя соответствия нумерации записей и порядок проб в издании и на пробах.

ВЫЖИТЬ в мире ГМОфобии

Интересные записи:

• Отчёт по преддипломной практике
• Отдел плауновидные. общая характеристика. особенности строения. цикл. воспроизведения равноспорового плауна булавовидного.
• Отечественные породы собак 1 глава
• Отечественные породы собак 5 глава