ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ:
изучить морфологию прокариот; особенности ультраструктуры бактерий, функции отдельных структур; ознакомиться с способами окраски и приготовления микропрепаратов для микроскопии.
СТУДЕНТ ОБЯЗАН ЗНАТЬ:
1. размеры бактерий и Основные формы.
2. Протопласты, сферопласты и L-формы бактерий.
3. Постоянные и непостоянные структуры бактериальной клетки.
Функциональное значение отдельных структурных компонентов.
4. Различия в структуре грамположительных и грамотрицательных бактерий. Состав. Функции.
5. Механизмы сотрудничества красителей с клеточной стенкой бактерий при окраске по Граму.
6. Способы изучения микроорганизмов в нативном и окрашенном состоянии. Простые и сложные способы окрашивания. Способы Грама, Циля-Нильсена, Ожешко, Нейссера, Бурри-Гинса, Романовского-Гимза.
СТУДЕНТ ОБЯЗАН МОЧЬ:
n приготовить препараты: живые (нативные), фиксированные;
n окрасить препараты методом и простым методом Грама.
СТУДЕНТ ДОЛЖЕН ИМЕТЬ ПРЕДСТАВЛЕНИЕ
о механизмах окраски структурных компонентов бактерий: клеточной стены кислотоустойчивых бактерий, спор, капсул, жгутиков, включений.
Работа №1 Морфология прокариот
Цель: сравнить формы и размеры микроорганизмов (см. теоретическую справку — Морфология прокариот)
Итог:
 |
|||
Итог:
 |
|||
Итог:
Вывод:
Работа№2. Изучение структуры клеточной стены
Цель: изучить структуру клеточной стены бактерий; освоить технику изготовление фиксированных препаратов.
Схема строения бактериальной клетки:
А) Назвать необходимые компоненты бактериальной клетки и охарактеризовать их
Б) Дать чёрта перечисленных структурных компонентов бактериальной клетки, способы их обнаружения, охарактеризовать участие в процессах метаболизма и значение структур для процессов репродукции, синтеза белка, энергетической, регуляторной, адгезивной функциях клетки.
Структурные компоненты бактериальной их функции и клетки:
| Постоянные их природа и компоненты | Функции | Способ обнаружения |
| Клеточная стена Гр + (пептидогликан, тейхоевые кислоты) Гр – ( пептидогликан, фосфолипиды, белки, ЛПС) | 1) Скелетная 2) Защитная 3) Рецепторная 4) Антигенная 5) Адгезивная 6) Транспортная 7) Нарушение синтеза клеточной стены ведет к образованию L-форм | Световая микроскопия, окраска по Граму |
| ЦПМ Двойной слой фосфолипидов с внедрёнными белками | 1) Главный осмотический барьер 2) Участвует в синтезе компонентов и регуляции роста клеточной стены 3) Транспорт питательных веществ в клетку и метаболитов из нее 4) Инвагинации участков ЦПМ — лизосомы — содержат ферменты, снабжающие биологическое окисление | Электронная микроскопия |
| Лизосомы Производные ЦПМ | 1) Аналог митохондрий, у эукариот снабжают синтез АТФ и процессы дыхания 2) Участвуют в делении клетки 3) Участвуют в спорообразовании | Электронная микроскопия |
| Цитоплазма Сложная коллоидная совокупность, складывается из воды, растворимых белков, РНК | Снабжает функционирование всех органелл | Электронная микроскопия |
| Рибосомы 70S | Несут ответственность за синтез белка | Электронная микроскопия |
| Нуклеоид Двунитевая молекула ДНК, замкнута в кольцо, хорошо уложена в виде клубка | Расположен в центре бактерий (одна хромосома) – носитель генетической информации | Электронная микроскопия |
| Непостоянные их природа и компоненты | Функции | Способ обнаружения |
| Капсула Слизистая структура, прочно связана с клеточной стенкой (полисахариды либо полипептиды) | 1) Защитная 2) Антигенная 3) Адгезивная | Световая микроскопия, окраска по Бурри, Бурри-Гинсу |
| Жгутики Складываются из белка-флагеллина, являющимся Н-антигеном Выпивали Складываются из белка |
Снабжают перемещение бактерий Выпивали 1го порядка снабжают адгезию к поражаемой микробной клетки. Выпивали 2го порядка – конъюгационные, снабжают перенос частиц генетического материала от донора к реципиенту | В мазках «висячая капля», «раздавленная капля», при фазово -контрастной микроскопии Электронная микроскопия |
| Плазмиды Дополнительные факторы наследственности в виде замкнутых колец ДНК с небльшой молекулярной массой | 1) Регуляторная – компенсация нарушений метаболизма ДНК клетки хозяина 2) Кодирующая – внесение в бактериальную клетку новой генетической информации | Электронная микроскопия |
| Включения Гликоген, полисахариды, бета-оксимасляная кислота, полифосфаты (валютин) | Запас питательных веществ | Световая микроскопия. Валютин окрашивают по Леффлеру либо Нейссеру |
| Спора Образуют Гр+ бактерии, из одной клетки образуется спора. Плотная многослойная оболочка, с громадным содержанием липидов и кальция низким содержанием воды | Сохранение генетической информации, при негативных условиях. Расположена: — субтерминально — терминально — центрально | Световая микроскопия, окраска по Ожешко. |
Схема построения клеточной стены:
А) Что нарисовано на схеме?
Б) Охарактеризовать главные компоненты объекта
В) Дать функциональную чёрта компонентов
Г) Главные различия двух типов
Д) Медицинское значение приведенного анализа?
Работа№3.Техника изготовление нативных (живых) препаратов. Изучение подвижности микроорганизмов
Личная работа: приготовьте мазок из кишечной культур палочки и смеси стафилококка, с окраской по Граму (см. теоретитечскую справку – Техника изготовление препаратов)
 |
Вывод:
Личная работа: изучение подвижности микроорганизмов
Итог
Вывод:
Теоретическая справка
К Работе№1
Морфология прокариот
Бактерии — это одноклеточные организмы растительного происхождения, но лишенные хлорофилла. Они относятся к прокариотам, видны в световой микроскоп, размеры их измеряются в микрометрах. Бактерии растут на неестественных питательных средах, размножение происходит двоичным делением.
Бактерии делятся
 |
патогенные(паразиты)условно-патогенныенепатогенные (сапрофиты)
вызывают заболевании челове- приводят к не вызывают забо-
ка, животных, растений при определенных усло- леваний
виях
Морфология — это форма, размер бактерий, размещение клеток в препарате. Различают три морфологических формы бактерий:
Различают три морфологических формы бактерий:
1) кокки 2) палочки 3) извитые
 |
|||
 |
|||
1. Кокки: форма — круглая
размер — небольшие
размещение в препаратах — 6 разновидностей:
а) микрококки б) диплококки в) тетракокки
 |
гонококки пневмококки
г) сарцины в) стафилококки д) стрептококки
 |
 |
 |
2. Палочковидные:
- форма — цилиндр
- размер: протяженность: толщина:
— большие — толстые
— средних размеров — узкие
— небольшие
- финиши палочек – закругленные (кишечная палочка)
— прямые (сибиреязвенная палочка)
— в виде утолщения (дифтерийная палочка)
- размещение — хаотичное
— в цепочку (стрептобактерии)
— попарно (диплобактерии)
— в виде римских цифр II, V, X и т.д.
3. Извитые: форма – спиралевидная:
1. спириллы,
2. кампилобактерии
Теоретическая справка
к Работе№3
Техника изготовление нативных (живых) препаратов
1. Приготовление мазка
1) с жидкой питательной среды 2) с плотной питательной среды
культуру берут петлей и каплю наносят на предметное стекло наносят
конкретно на стекло (без воды) маленькую каплю воды, в ко-
торой эмульгируют исследуемый
материал и распределяют по
площади около 2 см2 .
№ препарата пишут на лицевой стороне, а с обратной стороны местонахождения мазка обводят восковым карандашом.
2. Высушивание
на воздухе высоко над пламенем спиртовки
мазком вверх
3. Фиксация
Цель: — прикрепить микробов к стеклу
— обеззаразить патогенные микробы
— убитые микробы лучше окрашиваются
Способы
физическийхимический
— над пламенем спиртовки мазком — более щадящий по сравнению
вверх (3 раза круговыми перемещениями) с физическим: мазок погружа-
ют в фиксатор (этанол, ацетон, формалин и др.) на определенное время
4. Окраска
Способы
простыесложные
(ориентировочные) (дифференцирующие)
1) окрашивают одним красителем 1) применяют пара краси-
анилинового последовательности — главным либо телей (главная и вспомога-
кислым: — кислый фуксин тельные краски, обесцвечи-
-эозин вающие жидкости (этанол)
— метиленовый светло синий — способ Грама
— окраска по Нейссеру
— генциановый фиолетовый — Гинса-Бурри (обнаружение капсул)
— Циля-Нильсена (обнаружение
спор)
2) употребляются для изучения 2) употребляются для определе-
морфологии микроорганизмов ния не только морфологии, но
и состава и струк-
туры микробных клеток
В основном для окраски микроорганизмов применяют главные красители, в которых красящий ион — катион.
Краситель наливают на поверхность мазка на определенное время, после этого мазок промывают , пока струи воды не станут бесцветными, с опаской высушивают фильтровальной бумагой. В случае, если мазок верно окрашен и промыт, то поле зрения полностью прозрачно, а клетки микробов интенсивно окрашен.
Методика окраски по Граму:
1 этап. Употребляется главная краска генциановый фиолетовый, после этого раствор Люголя. Образуется прочное фиолетовый йод «и комплексное+соединение». Все микробы окрашиваются в светло синий-фиолетовый цвет.
2 этап. Обработка этанолом (разделение)
одни микробыдругие микробы
сохраняют комплекс генциановый теряют комплекс генциановый
фиолетовый+йод, не обесцвечиваются фиолетовый+йод, обесцвечиваются. это связано с тем, что: разъясняется тем, что:
-клеточная стена толстая, -клеточная стена микробов узкая,
-в ее состав входит довольно много пеп- -пептидогликана мало,
тидогликана,
-имеются тейхоевые кислоты — тейхоевых кислот нет
— по строению клеточная стена — структура клеточной стены
представляет собой прочное мозаичная, рыхлая, исходя из этого
образование, исходя из этого по окончании обра- по окончании обработки этанолом поры
ботки этанолом поры клеточной остаются прошлыми, краска
стены суживаются и краска не — вымывается, микробы обесцве-
вымывается. чиваются
3 этап. Окраска фуксином
одни микробыдругие микробы
остаются светло синий-фиолетовыми, окрашиваются в красный цвет,
грамположительные: грамотрицательные:
1.Все кокки за исключением 1.менингококки и Гонококки
гонококков и менингококков
2.Все спорообразующие палочки 2.Большая часть неспорообразующих
палочек
3.Из неспорообразующих бактерий 3.Спириллы
туберкулезная и дифтерийная палочки
4.Актиномицеты 4.Риккетсии
5.Грибы 5.Микоплазмы
Окраска по способу Грама не употребляется при изучении спирохет, несложных и вирусов.
Сущность способа окраски по Граму: отношение бактерий к окраске по Граму определяется их свойством удерживать появившийся в ходе окраски комплекс генцианового фиолетового и йода. У грамположительных бактерий главным веществом клеточной стены (до 90%) являются мукопептиды-муреин (пептидогликан). У грамотрицательных бактерий однослойный муреин находится в глубине клеточной стены, намного больше содержится белков и липидов, каковые вместе с полисахаридами образуют поверхностные слои в виде мозаики, их цитоплазма содержит РНК и ДНК в соотношении 8:1 и 1:1 соответственно. Помимо этого, проницаемость клеточной стены у грамположительных бактерий меньше, чем у грамотрицательных. Это разъясняется громадным содержанием мукопептида в составе клеточной стены грамположительных бактерий и меньшим диаметром пор, что содействует удержанию появившегося комплекса при обработке бактерий этиловым спиртом.
Методика окраски по способу Романовского-Гимзы:
Краска Романовского-Гимзы складывается из метиленового светло синий, азура и эозина.
1. На мазок наносят рабочий раствор красителя (2 капли красителя на 1 м дистиллированной воды) на 10-20 мин.
2. Препарат промывают водой и высушивают на воздухе.
Трепонемы окрашиваются в бледно-розовый цвет, боррелии — в фиолетовый цвет, лептоспиры — в розовый цвет. Сапрофитные (непатогенные) формы окрашиваются в светло синий цвет. Морфологию спирохет изучают кроме этого в живом состоянии в фазово-контрастном либо темнопольном микроскопе. Хорошим способом обнаружения спирохет есть серебрение по Морозову.
Методика окраски по способу Циля- Нильсена:
1. На фиксированный препарат – мазок нанести карболовый раствор фуксина через полосу фильтровальной бумаги и подогреть до появления паров в течении 3-5 мин;
2. Снять бумагу, промыть мазок водой;
3. Нанести 5% раствор серной кислоты либо 3% раствор смеси спирта с хлороводородной кислотой на 1-2 мин до обесцвечивания;
4. Промыть водой;
5. Докрасить мазок водным раствором метиленового светло синий в течении 3-5 мин;
6. Промыть водой, высушить, микроскопировать.
Методика окраски по способу Ожешко:
1. На нефиксированный мазок нанести 0,5% раствор хлороводородной кислоты и подогреть на пламени в течении 2-3 мин.
2. Кислоту слить, препарат промыть водой, просушить и фиксировать над пламенем. После этого окрасить по Цилю-Нильсену. Споры бактерий покупают красный цвет, а вегетативные формы- светло синий.